Takara Direct viral detection via qPCR
PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix를 이용한 RNA 추출 없는 SARS-CoV-2 직접 검출 프로토콜. 신속하고 간편한 RT-qPCR 기반 바이러스 검출. 다양한 호흡기 시료에 적용 가능. 사용자 최적화 가능 지침 포함.
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Overview
Protocol Guidelines for Direct SARS-CoV-2 Detection Using RT-qPCR
PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix는 Takara Bio 연구팀에 의해 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 검출에 성공적으로 사용된 바 있으며, SARS-CoV-2 양성 환자 시료에 대해서는 아직 시험되지 않았습니다. 그러나 다른 연구 그룹에서 SARS-CoV-2 검출을 위한 프로토콜 지침을 개발하였습니다.
Lübke et al.은 PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix를 이용한 호흡기 시료의 간단한 SARS-CoV-2 검출 프로토콜을 Journal of Clinical Virology 논문에서 발표하였습니다. 논문 제목은 Extraction-free SARS-CoV-2 detection by rapid RT-qPCR universal for all primary respiratory materials이며, 아래는 해당 프로토콜의 요약으로 사용자가 최적화할 수 있습니다.
RNA-Extraction-Free SARS-CoV-2 Detection Protocol
이 프로토콜은 Lübke et al.에 의해 개발되었으며, SARS-CoV-2 검출을 위한 지침으로 사용할 수 있습니다. Takara Bio 연구팀에서 환자 시료를 대상으로 검증하지는 않았습니다.
Sample Collection
- 반응 민감도를 유지하기 위해 시료를 냉동하거나 4°C에서 7일 이상 보관하지 마십시오.
- 모든 1차 호흡기 시료에 적용 가능합니다.
- 점성이 높은 시료는 Remel Sputasol (Thermo Fisher Scientific)로 전처리합니다.
- 시료 50 µl를 99°C에서 5분간 가열 비활성화합니다.
- 가열된 시료를 4,000 rpm에서 5분간 원심분리합니다.
- 상등액 5 µl를 반응 혼합물에 첨가합니다.
Reaction Mix
반응 혼합물(시료 제외)은 대량으로 준비 후 20 µl씩 분주하여 최대 1주일간 냉동 보관할 수 있습니다.
| Reagent | Volume |
|---|---|
| PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix (2X) | 12.5 µl |
| Forward Primer | 아래 표에 따라 계산 |
| Reverse Primer | 아래 표에 따라 계산 |
| qPCR Probe | 아래 표에 따라 계산 |
| Viral PBS Sample | 5 µl |
| RNase-Free H₂O | 25 µl까지 보충 |
| Total | 25 µl |
Primers and Probes for SARS-CoV-2 Detection and Internal Control
| Name | Target | Sequence | Final Conc. in Rxn |
|---|---|---|---|
| CoV-E-F | E gene | CTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCT | 400 nM |
| CoV-E-R | E gene | TACAAGACTCACGTTAACAATATTGCA | 400 nM |
| CoV-E-Pr | E gene | FAM-CTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTG-BHQ | 200 nM |
| HBV‑Taq1 | HBV‑SynQ* | CAACCTCCAATCACTCACCAAC | 200 nM |
| HBV‑Taq2 | HBV‑SynQ* | ATATGATAAAACGCGCAGACAC | 200 nM |
| HBV‑IC | HBV‑SynQ* | Cy5-CTGCCGAGCTCTGACTA-BHQ | 200 nM |
*HBV‑SynQ (internal control): 비활성화된 B형간염 표면항원을 암호화하는 합성 플라스미드.
Thermal Cycler Program
| Step | Temperature | Time | Description |
|---|---|---|---|
| Enzyme Activation | 95°C | 30 sec | |
| Reverse Transcription | 60°C | 5 min | |
| Denaturation | 95°C | 5 sec | 45 cycles |
| Annealing/Extension | 60°C | 30 sec |
이 프로토콜을 통해 저자들은 Ct 값 <35에서 95.8%의 높은 검출률과 전체 81.3%의 검출률을 보고하였습니다. 본 방법은 유연성과 속도가 뛰어나며, 1시간 이내에 모든 호흡기 시료에서 SARS-CoV-2를 검출할 수 있습니다.
More Information
저장 조건, 구성 성분 및 기술 사양은 제품의 Certificate of Analysis를 참고하십시오.
Kit Components List는 Documents 탭에서 확인할 수 있습니다.
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