카운팅 챔버(counting chamber)란?

1. 기원

카운팅 챔버의 시작은 Hemocytometer(헤모사이토미터)에서 시작되었습니다.
이름에서도 기원을 알 수 있듯이 원래는 혈액 세포의 숫자를 정확하게 세기 위해 발명된 제품입니다.

위의 그림은 말라세즈가 고안한 원조 헤모사이토미터의 격자 무늬입니다.
바이오 연구실에서 흔히 접하는 Grid 패턴과는 좀 차이가 있죠?
동물 세포를 주로 카운팅 하는 바이오 연구실에서는 Neubauer-improved 라 불리는 grid pattern 을 가장 많이 사용합니다.
사실 hemocytometer의 격자 무늬는 샘플에 따라 다양한 형태로 존재합니다.
예를 들면 CSF (cerebrospinal fluid) 에 있는 leukocyte를 카운팅하는 목적으로는 Fuchs Rosenthal grid 를 많이 사용하고,
미생물 쪽에서는 Thoma grid pattern 을 많이 사용합니다.
그 외에도 샘플의 크기나 특성을 고려해서 좀더 편한 방법으로 셀수 있도록 많은 Grid 패턴이 개발되어 왔습니다.
대체로 적용되는 rule 은 혈소판이나 적혈구 같은 작은 입자들은 작은 격자를 이용해서 세고, 백혈구와 같이 큰 세포들은 큰 격자를 이용한다는 것입니다. 다양한 격자패턴에 따른 hemocytometer 종류는 아래 그림에서 정리해 보았습니다.

일반적으로 Hemocytometer는 100 마이크로미터의 높이를 가지고 있습니다.
즉 cover glass 를 덮었을 경우 샘플이 들어가는 공간의 높이가 100 um 인 셈입니다.
이 높이는 경험적으로 정해진 것인데
예를 들어 200 마이크로미터 이상의 공간이라면 세포가 가라 앉는데 지나치게 많은 시간이 필요하고,
수십 마이크로 미터 높이라면 아예 세포가 잘 들어가지 않을 수 있습니다.

아주 작은 크기의 세포들, 예를 들어 박테리아의 경우에는 100 um 높이의 챔버를 잘 사용하지 않습니다.
보통 상용화되어 있는 세균용 counting chamber 들은 높이가 20 마이크로미터 이하인데
위와 같은 연유로 인해 높이가 결정된 것입니다.
물론 세균 카운팅을 목적으로 사용되고 있는 counting chamber 들은 생김새가 헤모사이토미터와 비숫하고 격자고 가지고 있지만 헤모사이토미터라고 부르진 않습니다.
그냥 counting chamber 라고 부르는 것이 보통입니다.
샘플이 헤모(Hemo) 라는 어원과 너무 멀어서 그런 것이겠지요.

2. 사용법

⇡ 위 제품에 대한 구매 링크 입니다.

위 그림을 보시게되면 저희 사이트에서 판매되고 있는 제품에 커버글라스를 덮운 것에 대한 도식화 한 그림입니다.
제품 우측 상단에 보시면 패턴 모양에 대해 언급이 되어 있고, 좌측 상단에는 높이가 언급되어 있네요.
즉 위 제품은 Neubauer-improved 패턴을 갖고 있는 grid에 높이 100um인거죠!
다시 본론으로 들어가서 Coverslip mounting support 의 높이와 샘플이 위치하게 되는 가운데 부분의 높이차를
100 um 로 유지하는 것이 헤모사이토미터 제조의 핵심적인 부분입니다.

그림에서 Specimen insertion 이라고 표시한 부분에 샘플을 떨어뜨리게 되는데 이쪽에 샘플을 주입하면 전체 챔버 영역으로 샘플이 모세관현상에 의해 이동하게 됩니다.

Polished Coverslip Mounting Support 와 챔버 영역 (dark grey 부분) 사이에 있는
V 자 홈은 샘플이 이동중에 다른 곳으로 넘치지 않도록 하기 위한 장치입니다.
모세관 현상의 특성상 좁은 영역에서 갑자기 넓은 영역을 만나면 capillary force가 약해지는 원리를 이용한 것입니다.
즉, 이러한 V자 홈을 좌우측에 배치함으로써 샘플은 오직 챔버 영역에만 머무르게 됩니다.

이제 헤모사이토미터 내부의 격자를 조금 더 자세히 살펴보겠습니다.
아래 그림은 세포 샘플을 trypan blue 로 염색한 뒤 현미경 4x 대물렌즈에서 관찰한 사진입니다

격자에 대한 모식도는 아래와 같습니다. 붉은색으로 표시한 두개의 사각형이 있는데 각각의 사각형은 모두 가로 X 세로 = 1mm X 1mm 의 면적을 가지고 있습니다. 즉 이 사각형 한개에 샘플이 있다면 샘플의 부피는 1mm X 1mm X 0.1 mm (가로, 세로, 높이) = 0.1 uL 가 됩니다. 보통 원액 샘플의 농도는 / ml 로 표시하기 때문에 여기에 10^4 (10의 4승)을 곱하면 ml 당 농도를 산출할 수 있습니다.
0.1 uL = 0.1 x 10^(-3)mL ➨ 1 X 10^4 / mL

예를 들어 붉은 색 큰 사각형 하나 속에 100개의 세포가 관찰되었다면 100 X 10^4= 1X10^6/ml 로 계산이 됩니다. 만약 붉은 색 큰 사각형 5개에 있는 세포수를 세었는데 1000개의 세포가 보였다면 각 사각형당 평균 숫자는 5로 나눈 200개가 되고 여기에 10의 4승을 곱해 200 X 10^4= 2x10^6/ml 이 됩니다.

헤모사이토미터의 격자 생김새가 다르다 보니 간혹 가운데 사각형이 정확하다고 믿는 분이 있는데 이는 큰 오해입니다.
위에서 보이는 9개의 모든 사각형의 영역은 고작 3mm X 3mm 로 챔버 전체 영역에 비하면 매우 작은 부분만을 관찰하는 것입니다. 따라서 인접한 이들 사각형 사이에서 정확도가 더 높거나 낮은 부분이 존재하지는 않습니다.
물론 세포가 모세관 현상으로 인해 흐르다 보니 각 격자별로 세포숫자는 차이가 날 수 있습니다만,
그 중에서 어느 격자가 더 정확한지를 논하는 것은 무의미하다고 하겠습니다.
아래 영상은 카운팅 챔버를 다루는 모습에 대한 영상이에요! 참고 하세요~^^

3. Dark line vs Bright line차이점

저희 사이트에서 주로 판매되고 있는 counting chamber는 Dark Line인데요.
그렇다면 Dark Line과 Bright Line에 대한 차이점은 뭘까요?
좌측이 Dark line 우측이 Bright line이 같지만 정반대입니다.
좌측이 Bright line 우측이 Dark line 입니다.

그렇다면 왜 좌측을 Bright Line 우측을 Dark LIne이라고 부를까요?
위 사진을 보시면 아실 수 있습니다.
중간 부위를 확대한 사진인데요!
좌측이 Bright line 우측이 Dark line 입니다.
즉, 보여지는 선에 따라서 밝게 보여지면 Bright Line, 어둡게 보여지면 Dark LIne인거죠!!

아래 사진을 보시면 선이 밝은색이니 Bright Line의 counting chamber가 쓰인걸 알 수 있겠죠?