고형암 표적 CAR-T 세포 치료: 국가출하승인을 위한 생리활성 시험

CAR-T 세포의 생리활성 측정은 제품의 품질을 정의하는 데 중요하게 작용합니다.

T세포 치료제는 혁신적이며, 어떤 경우에는 치료 효과가 있지만 한계 또한 상당합니다. 3부로 구성된 CAR-T 치료제의 혁신 시리즈에서 CAR-T 세포 치료제가 설계 및 제조되는 방법과 체내 실험을 통해 검증되는 방식을 확인하십시오. 오늘날 우리는 생리활성을 측정하기 위해 체외에서 효능을 평가할 방법을 찾고 있습니다.

최근 몇 년간의 발전에도 불구하고, 복잡한 치료법에 대해 작용 기전(MoA)을 반영하는 세포 기반 생리활성 분석을 찾는 과정은 여전히 까다롭습니다. CAR-T 치료제와 같은 약물의 복잡성이 MoA를 반영하는 분석 자체의 복잡성보다 높을 경우 어려움은 배가 됩니다.

CAR-T 세포의 생리활성은 공여자 가변성, 형질주입 효율성, CAR 구조, 유전자 벡터, 세포 배양 조건, 세포 비율 등 여러 다양한 요인의 영향을 받습니다. MoA를 반영하는 생물학적 분석은 이러한 변수의 원인을 모두 파악하여 표준 배치와의 비교를 통해 상대적인 생물학적 기능을 측정할 수 있어야 합니다. 그리고 이를 달성하게 되면 제조 공정의 품질과 일관성이 보장될 것입니다. 또한 제조 공정이 변경되면 안정성과 비교동등성을 측정할 수 있어야 합니다. 이러한 문제를 모두 고려할 때 제품의 변수와 관련된 문제를 해결하려면 국가출하승인 방법이 신뢰할 수 있고 재현 가능하며 표준화에 적합해야 하는 것은 물론 실험실에서도 쉽게 실행할 수 있어야 합니다.

생리활성은 각 CAR-T 제품별로 차이가 크며 표적에 따라서도 달라집니다. 따라서 MoA를 반영하는 “올바른” 생물학적 분석을 신중히 선정해야 합니다. 개별 제품마다 표적에 따라 적합한 표적 세포계를 설정하고 효과기세포와 표적세포의 비율, 배양 시간 등 모든 분석 조건을 최적화해야 하므로 각각의 분석을 확립해야 합니다. 선정한 생리활성 분석의 적합성은 규제 기관에서 사례별로 평가합니다. 이상적인 경우에 MoA 반영 분석은 관련된 생물학적 기능을 확인하는 생물학적 특성 분석을 기반으로 합니다.

MoA 반영 생리활성 판독

생리활성 시험의 잠재적 판독은 IFNg 또는 TNF와 같은 표적 세포가 있을 때 CAR-T 세포 활성화에 의한 사이토카인 방출, CAR-T 세포에 의한 표적 특이적 제거 활성화, CD25 또는 CD95와 같은 세포표면 마커 활성화 여부 중 하나를 기반으로 합니다. 생리활성 분석의 종류를 설명해 보겠습니다.

사이토카인 방출: ELISA 분석에는 배경 문제, 제한된 농도 범위, 다양한 시약 첨가와 중간 세척 과정으로 인해 여러 단계를 거쳐야 한다는 단점이 있지만 이전부터 사이토카인 방출 측정에 사용되어 왔습니다. 그러나 기존 ELISA 발광 판독은 민감성이 매우 높은 방법으로 농도 범위를 개선할 수 있는 반면에, 세척의 필요성이 없는 접근은 더욱 신속한 분석이 가능하며 실험실 오류가 발생할 위험도 줄어듭니다. 발광 판독은 민감성이 매우 높은 방법으로 농도 범위를 개선할 수 있으며, 세척이 필요 없어 더욱 신속한 분석이 가능하며 실험실 오류가 발생할 위험도 줄어듭니다. 사이토카인 방출 분석의 단점은 표적 유도 사이토카인 분비가 T세포 활성화에 의한 결과인 것은 분명하지만, 실제로 MoA 반영 CAR-T 활성으로 인한 것인지는 확인하기 매우 어렵다는 점입니다. CAR-T 세포가 활성화된 상태에서 표적 세포가 제거되는 결과가 나타나야 인과 관계를 더 분명히 알 수 있을 것입니다.

세포 사멸: 세포 사멸 분석은 MoA를 상당 부분 반영하지만, 시간이 훨씬 오래 걸리고 비특이적 배경에 심각한 문제가 나타나기도 합니다. 이러한 문제는 발광 판독과 넓은 농도 범위(아래 그림 2 참조)를 통해 세포 주기 분석을 간소화하는 특정 유전자 변형 표적 세포를 이용하면 해결할 수 있습니다.

세포표면 마커 활성화: 특정 마커의 활성화를 측정하는 기존 유세포 분석은 처리량이 제한적이며, CAR-T 효과기세포와 특정 표적세포의 공동 배양을 통해 생성된 복잡한 데이터를 처리할 수 있는 숙련된 직원이 필요합니다.

그림 1: Promega LUMIT 기술

LUMIT 기술은 발광 판독을 이용하여 배경 문제를 줄이고 농도 범위를 개선했으며 기존 ELISA 분석에 비해 세척이 필요 없어 더욱 신속하고 안정적인 방법입니다. (이미지 제공: Promega)

Promega HiBiT 기술용 CAR-T 이미지

그림 2. Promega HiBiT 기술(세포 사멸 분석)

HiBiT 세포 사멸 분석은 관심 수용기와 HiBit 융합 단백질을 운반하는 변형된 표적 세포계를 기반으로 합니다. HiBiT와 LgBit가 활성 효소를 형성하면 CAR-T 효과기세포가 있는 상태에서 표적세포가 누출되고 푸리마진(furimazine) 기질이 절단됩니다. 발광 판독을 이용합니다.

모든 방법은 재현 가능한 결과를 얻기 위해 적절한 효과기세포와 표적세포의 비율, 배양 시간을 꼼꼼하게 선정해야 합니다. CAR-T 세포의 복잡한 특성으로 인해 잘 통제된 제조 공정에서도 최적 조건이 로트마다 달라 선정이 어려울 수 있습니다.

이러한 점을 고려하면서 관련 지침을 읽으면 해결해야 할 문제를 명확히 파악할 수 있습니다. 생리활성 분석은 정확성, 민감성, 특이성, 재현성을 확립하고 문서화되어야 하며 검증을 위한 작성도 가능해야 합니다. 수용 및 기각 기준도 사전에 정의되어 있어야 합니다. 따라서 철저한 분석 방법 개발에는 충분한 시간을 두고 방법 및 시험 항목의 기능과 한계를 파악한 후 검증과 분석의 수용 기준을 합리적으로 설정하는 것이 중요합니다. 또한 로트의 크기가 제한되어 있음을 이해하고 적절한 표준물질과 대조물질을 이용해야 합니다.

Written by Charles river
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