Merck Human Whole Genome SAM CRISPRa Pooled Lentiviral Library Kit Zeo

Human Whole Genome SAM CRISPRa Pooled Lentiviral Library Kit Zeo

제품 개요

본 키트는 인간 전장 유전체를 대상으로 하는 CRISPRa 시스템 기반의 렌티바이러스 라이브러리로, 유전자 활성화 연구를 위한 고효율 스크리닝을 제공합니다. VP64-dCas9 복합체와 MS2-p65-HSF1 코액티베이터를 이용하여 전사 활성화를 유도합니다.

구성 및 포장

• 총 40 바이알 (5개 구성 요소 각각 8×25 μL aliquots)
• 3개의 서브풀로 구성 (각 서브풀 약 23,500 gRNA 포함)
• 전체 라이브러리 약 70,000 gRNA 포함 (19,000 유전자 타겟)

기술 설명

VP64가 융합된 nuclease-dead SpCas9(dCas9)은 CRISPR guide RNA(gRNA)와 결합하여 RNP 복합체를 형성합니다. gRNA scaffold의 stem 및 tetra-loop 서열은 최소 hairpin RNA aptamer로 변형되어, MS2 박테리오파지 코트 단백질과 선택적으로 결합합니다. MS2 코트 단백질은 NFκB의 p65 서브유닛과 인간 heat-shock factor 1(HSF1)의 활성화 도메인과 융합되어 있습니다.

각 gRNA는 두 개의 aptamer를 포함하며, 각 aptamer는 두 개의 MS2 코액티베이터 단백질을 결합할 수 있어, 하나의 CRISPR 활성화 복합체당 총 4개의 코액티베이터를 모집합니다.

dCas9-VP64, MS2-p65-HSF1 헬퍼 구성체 및 gRNA는 각각 개별 플라스미드 또는 렌티바이러스 입자로 제공됩니다. 배열형 gRNA 라이브러리와 달리, 본 pooled 라이브러리는 수천 개의 gRNA를 단일 튜브에 포함하여 로보틱스나 특수 장비 없이 벤치탑 수준에서 효율적인 전장 스크리닝을 수행할 수 있습니다.

대조군 및 데이터 분석

각 pool에는 100개의 비타겟(negative) gRNA가 포함되어 있으며, 이는 시퀀싱을 통한 gRNA 빈도 변화의 통계적 특성화를 위한 기준선으로 활용됩니다. 비타겟 gRNA는 표적 유전체와 최소한의 상동성을 가지며, 처리 과정 중 표현 빈도의 유의한 변화가 없어야 합니다. 양성 대조군은 실험 목적에 따라 개별적으로 설정해야 합니다.

장점

• 인간 전장 유전체 수준의 CRISPRa 스크리닝 가능
• 효율적인 pooled 라이브러리 구성
• 음성 대조군 포함으로 데이터 신뢰도 향상
• 특수 장비 없이 벤치탑 수준 실험 가능