Thermo Fisher Scientific LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM, 5 mg

LiveBLAzer™ FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM

배경

GeneBLAzer™ 세포 기반 분석법은 음전하 형광 beta-lactamase 기질인 CCF2 및 CCF4의 막투과성 에스테르형(CCF2-AM, CCF4-AM)을 이용합니다. 이러한 친지질성 에스테르는 세포 내로 쉽게 침투하며, 내인성 cytoplasmic esterase에 의해 절단되어 음전하 형태로 변환되어 cytosol에 포집됩니다.

GeneBLAzer™ assay의 검출은 FRET(Förster Resonance Energy Transfer)을 이용합니다. 각 기질에는 효율적인 FRET pair를 이루는 두 개의 형광체가 결합되어 있습니다. Beta-lactamase 활성이 없는 상태에서는 완전한 CCF2 분자가 coumarin(409 nm 여기)에 의해 fluorescein으로 FRET되어 518 nm의 녹색 형광을 방출합니다. 반면, beta-lactamase 활성이 있을 경우 CCF2가 절단되어 두 형광체 사이의 FRET가 손상되며, coumarin이 409 nm에서 여기되어 447 nm의 청색 형광을 방출합니다. 이 청색 신호는 현미경 또는 형광 microplate reader를 통해 쉽게 검출할 수 있습니다.

CCF2-AM과 CCF4-AM 기질은 GeneBLAzer™ platform의 핵심 구성 요소로, flow cytometry와 완전히 호환되어 클론 선택 시간을 단축합니다. 청색 및 녹색 신호의 ratiometric 분석은 세포 수 및 기질 로딩 차이에 의한 변동성을 줄여 높은 Z´-factor와 낮은 변동계수(CV)를 제공합니다.

CCF2-AM과 CCF4-AM은 coumarin moiety와 lactam ring을 잇는 브릿지 결합의 탄소 수에 따라 구분됩니다. 두 기질 모두 세포 투과성 에스테르화 형태로 온전한 세포 분석에 적합합니다. 특히 CCF4-AM은 CCF2-AM보다 용해성이 우수하여 24시간 이상 안정적으로 용해 상태를 유지하며, 스크리닝 어플리케이션에 적합합니다. 또한 FRET 효율이 높아 CCF2-AM 대비 낮은 background 신호를 제공합니다.

CCF2-FA는 에스테르화되지 않은 CCF2 기질로, 세포용해 기반 어플리케이션이나 세포막 투과 로딩 및 탈에스테르화 단계에 사용됩니다. CCF2-FA는 CCF2-AM 및 CCF4-AM의 여기 및 방출 스펙트럼 비교를 위한 control로도 활용됩니다.

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